Übrige PCR-basierte Untersuchungsmethoden

 

Sanger Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung nach PCR-Amplifikation der DNA dient der Suche nach Mutationen innerhalb definierter Genomabschnitte. Die Auswertung der Sanger-Reaktionsprodukte erfolgt durch Kapillarelektrophorese, einer Verbesserung der initial von Sanger eingesetzten Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Das Verfahren hat seinerzeit massgeblich die Sequenzierung ganzer Genome ermöglicht und geprägt, bevor es durch Parallelsequenzierung (Next Generation Sequencing, NGS) weitgehend ersetzt wurde. Gleichwohl ist die Sanger-Technik immer noch der Referenzstandard der Gensequenzierung, anhand dessen neue Technologien verifiziert werden. Sie wird bei uns auch heute noch zur Validierung verwendet und findet Einsatz bei Genen, die nicht in NGS-Panels erfasst werden. Ferner erlaubt sie eine freie Kombination mit anderen molekularbiologischen Techniken, z. B. eine Sensitivitätssteigerung bei der Mutationssuche in KIT, Kodon D816 nach vorausgehendem Restriktionsverdau.

 

Fragmentlängenanalyse & MLPA

Diese Methoden basieren wie die Sanger-Sequenzierung auf kapillarelektrophoretischer Auftrennung gezielt erzeugter PCR-Produkte aus Proben-DNA, die hiermit visualisiert werden. Je nach PCR-Ansatz ist die Technik einsetzbar zur Klonalitätsanalyse bei lymphoproliferativen Erkrankungen, zur Bestimmung der Mikrosatelliteninstabilität bei Karzinomen oder auch als Endschritt bei der sog. Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA). Letztere molekularbiologische Technik beruht auf einer Ligasereaktion zur simultanen Ermittlung der Kopienzahl genomischer Loci sowie Detektion bestimmter Punktmutationen, z. B. in Hirntumoren.

 

Humane Papillomavirus (HPV) Genotypisierung

Eine Genotypisierung ist notwendig, um festzustellen, ob eine HPV-Infektion besteht und ob diese mit einem erhöhten Risiko für eine Progression bzw. Karzinomentstehung einhergeht. Es wird hierzu ein quantitatives PCR-Verfahren verwendet, welches nicht nur zwischen high risk und low risk HPV Genotypen unterscheidet, sondern in den allermeisten Fällen auch die involvierten genauen HPV Typen (auch bei Mehrfachinfektionen) ermittelt. Die Methode kann für alle zytologischen Verfahren, aber auch für formalinfixiertes, paraffineingebettetes und natives Gewebe verwendet werden.

 

Nachweis von Genfusionstranskripten

Für dieses Verfahren wird RNA (und nicht DNA) benötigt, was besondere Anforderungen an die Qualität des Untersuchungsmaterials stellt. Am besten ist natives Gewebe geeignet, wenngleich in Abhängigkeit vom Gewebserhalt (RNA ist biologisch zur schnellen Degradation bestimmt) der Nachweis auch teilweise aus fixiertem Gewebe möglich ist. Das unfixierte Material (z.B. auch Blut oder Knochemarkaspirat) muss innerhalb kurzer Zeit und gekühlt unser Institut erreichen. Zur Stabilisierung der RNA kann das Reagens "RNA later" eingesetzt werden. Für Blut-/ Knochenmarksentnahmen können wir entsprechende Röhrchen zur Verfügung stellen.

Die RNA wird nach Extraktion in mittels reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben und mittels fusionsspezifischer Primer amplifiziert. Anschliessend belegt das Vorhandensein entsprechender PCR-Produkte das Vorliegen der jeweiligen Genfusion. Je nach Gen erfolgt der Nachweis entweder konventionell mittels Gelelektrophorese oder neuerdings auch im Rahmen RNA-basierter NGS-Panel mit dem Parallelsequenzierungsgerät (siehe Archer® FusionPlex® Sarcoma kit). Beispiele diagnostischer Anwendung sind Translokationen beim Ewing Sarkom (z.B. EWS-FLI1 und EWS-ERG) und die FIP1L1-PDGFRA Translokation bei myeloproliferativen Erkrankungen des Knochenmarks mit Eosinophilie (sog. myeloide und lymphoide Neoplasien mit Eosinophilie und Abnormalitäten von PDGFRA, PDGFRB und FGFR1). Das Archer® FusionPlex® Sarcoma kit (NGS-Panel) ist für den Einsatz an fixierten Paraffin-Gewebeproben optimiert und kann simultan Fusionen von 26 Genen identifizieren, die bei Weichgewebstumoren bekannt sind, ohne die potenziellen Fusionspartner oder Bruchpunkte zu kennen.

Das detaillierte Spektrum unserer molekularen Analysen finden Sie auf folgenden Einsendeformularen: