Sonstige Methoden

 

Sanger Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung nach PCR-Amplifikation der DNA dient der Suche nach Mutationen innerhalb definierter Genomabschnitte. Die Auswertung der Sanger-Reaktionsprodukte erfolgt durch Kapillarelektrophorese, einer Verbesserung der initial von Sanger eingesetzten Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Das Verfahren hat seinerzeit massgeblich die Sequenzierung ganzer Genome ermöglicht und geprägt, bevor es durch Parallelsequenzierung (auch next generation sequencing, NGS) weitgehend ersetzt wurde. Nichtsdestotrotz ist die Sanger-Technik auch heute noch der Referenzstandard der Gensequenzierung, anhand dessen neue Technologien validiert werden. Die Sanger-Sequenzierung findet bei uns vor allem noch Verwendung als kostengünstige Bestimmungsmethode von Mutationen in einzelnen Genbereichen. 

 

Fragmentlängenanalyse mittels Kapillarelektrophorese

Diese Methode basiert, wie die Sanger-Sequenzierung, auf kapillarelektrophoretischer Auftrennung gezielt erzeugter PCR-Produkte aus Proben-DNA und deren Längenbestimmung. Je nach PCR-Ansatz ist die Technik zur Klonalitätsanalyse bei lymphoproliferativen Erkrankungen oder zur Bestimmung der Mikrosatelliteninstabilität bei Karzinomen einsetzbar.

 

Droplet digital PCR

Bei der droplet digital PCR (ddPCR) wird die DNA-Probe in viele (bis 20’000 pro Reaktionsansatz) Tröpfchen (droplets) in einer Wasser-Öl-Emulsion aufgeteilt. Anschliessend wird in jedem dieser einzelnen Tröpfchen eine mutations-spezifische PCR mit Fluoreszenz-gekoppelten TaqMan-Sonden durchgeführt. Alle Tropfen werden danach auf das Vorhandensein einer Mutation untersucht, wobei jene fluoreszieren, in denen eine mutations-spezifische Amplifikation stattgefunden hat. Die Analyse findet mit Hilfe eines modifizierten Fluoreszenz-Durchflusszytometers statt. In der Regel werden zwei Farbstoffe verwendet, um das mutierte Allel vom Wildtyp-Allel zu unterscheiden. Das Verhältnis der beiden Farbsignale entspricht der Allelfrequenz der Mutation (Anzahl mutierter Allele pro Gesamtzahl der Allele im Tumorgewebe). Zur Suche nach Einzelgen-Veränderungen ist die ddPCR eine sehr robuste Methode, da dabei im Gegensatz zum Sanger-Verfahren immer auch die Allelfrequenz bestimmt wird, was die Befundinterpretation erleichtert. Aufgrund der quantitativen Resultate kann die ddPCR unter anderem auch zur Bestimmung von Genamplifikationen, Deletionen und DNA-Methylierung eingesetzt werden.

 

Humane Papillomavirus (HPV) Genotypisierung

Eine Genotypisierung ist notwendig, um festzustellen, ob eine HPV-Infektion besteht und ob diese mit einem erhöhten Risiko für eine Progression bzw. Karzinomentstehung einhergeht. Es wird hierzu ein quantitatives PCR-Verfahren verwendet, dass nicht nur zwischen high risk und low risk HPV Genotypen unterscheidet, sondern in den allermeisten Fällen auch die involvierten genauen HPV Typen (auch bei Mehrfachinfektionen) ermittelt. Die Methode kann für alle zytologischen Verfahren, aber auch für formalinfixiertes und paraffineingebettetes und natives Gewebe verwendet werden. Diese Analyse wird in Zusammenarbeit mit der Klinischen Virologie der Labormedizin des Universitätsspital Basel durchgeführt.

 

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